Разлика између клонирања гена и ПЦР-а

Кључна разлика - Гене Цлонинг вс ПЦР
 

Синтеза многих копија ДНК из одређеног фрагмента ДНК назива се амплификација ДНК. Постоје два главна процеса амплификације ДНК, а то су клонирање гена и ПЦР. Кључна разлика између клонирања гена и ПЦР је, клонирањем гена настаје вишеструка копија одређеног гена ин виво конструишући рекомбинантну ДНК и растући у бактерији домаћину док ПЦР производи милионе копија одређеног ДНК фрагмента ин витро подвргнути поновљеним циклусима денатурације и синтезе.

САДРЖАЈ
1. Преглед и кључне разлике
2. Шта је генско клонирање
3. Шта је ПЦР
4. Упоредна упоредба - Гене Цлонинг вс ПЦР
5. Резиме

Шта је ген Клонирање?

Клонирање гена је техника која се користи за проналажење и умножавање одређеног гена из извучене геномске ДНК организма кроз изградњу рекомбинантне ДНК. Геномска ДНК садржи хиљаде различитих гена кодираних за протеине. Када се ДНК издвоји, укључује све могуће гене које може да носи. Техника клонирања гена омогућила је детекцију специфичног гена из укупне ДНК. Стога је клонирање гена важно средство у молекуларној биологији.

Стварање геномске библиотеке организма је од суштинског значаја за клонирање гена ако нема појма о локацији одговарајућег гена у ДНК. Геномска библиотека се прави следећим корацима.

Корак 1: Екстракција целокупне ДНК из организма који садржи жељени ген.

Корак 2: Рестриктивно варење екстраховане ДНК да би се добили мали фрагменти који се могу управљати. Овај корак је олакшан рестрикцијским ендонуклеазама.

Корак 3: Одабир погодног вектора и отварање векторске ДНК коришћењем исте рестрикцијске ендонуклезе. Бактеријски плазмиди се обично користе као вектори за ношење стране ДНК. Плазмиди су мали кругови ДНК смештени унутар бактерија.

4. корак: Комбиновање векторске ДНК и фрагментиране ДНК за производњу рекомбинантног молекула ДНК. Овим кораком управља ДН лигаза.

Корак 5: Пренос рекомбинантних молекула ДНК у бактерије домаћина. Овај корак је познат као трансформација и изводи се употребом топлотног удара.

Корак 5: Преглед трансформисаних бактеријских ћелија на медијуму културе. На крају процеса трансформације добија се мешовита популација трансформисаних и нетрансформисаних ћелија домаћина. Као интересни ген укључује само трансформисане ћелије домаћина. Отуда је потребно одабрати трансформисане ћелије. Избор се врши коришћењем селективних медија који садрже антибиотике. Само трансформисане ћелије расту на овом медију за скрининг који омогућава селекцију.

Корак 6: Узгој бактерија за производњу генске библиотеке. У овом кораку, трансформисане ћелије домаћина се уводе у медијум за свежу културу што обезбеђује оптималне потребе за растом. Укупне колоније на културама представљају геномску библиотеку тог организма.

Корак 7: Рекомбинантни молекул ДНК који садржи ген који вас занима мора бити претражен на хиљаде клонираних фрагмената рекомбинантне ДНК. То се може постићи употребом сонди које обележавају специфични ген или специфични протеин који је резултат тог гена.

Једном када је заинтересовани ген који садржи бактеријску колонију идентификован из укупних колонија, могуће је направити милионе копија рекомбинантног плазмида који садржи ген.

Клонирање гена користи се у успостављању библиотека гена, производњи посебних протеина, витамина, антибиотика, хормона, секвенцирању и мапирању генома организама, правећи вишеструке копије ДНК појединаца у форензичким медицинама итд..

Слика_1: Клонирање гена

Шта је ПЦР?

Полимерна ланчана реакција (ПЦР) је техника која ствара велики број копија одређеног ДНК фрагмента. Експоненцијална амплификација одређене ДНК секвенце добије се помоћу ПЦР под ин витро услови. Ова техника је веома моћно средство у молекуларној биологији јер може да умножи мали узорак ДНК у употребној количини. ПЦР је увео Кари Муллис 1983. године и овај наградни проналазак створио је огроман напредак у молекуларној биологији.

ПЦР техника прати понављане ПЦР реакције као што је приказано на слици 02. Једна ПЦР реакција састоји се од три главна корака који се одвијају на три различите температуре; денатурацију двоструке ланчане ДНК на 94 ⁰Ц, жарење прајмера на 68 ⁰Ц и продужење жице на 72 ⁰Ц. Због тога, када се врши ПЦР, треба одржавати флуктуацију температуре ради правилне репликације. ПЦР се изводи у ПЦР машини унутар ПЦР епрувета. ПЦР епрувете су напуњене исправним ПЦР смешама које садрже шаблонску ДНК, Так полимеразу, прајмере, дНТПс и пуфер. Денатурирање дволанчане ДНК узорка у једноланчане ДНК врши се разбијањем водоничних веза између комплементарних база на 94 - 98 ⁰Ц. Затим су појединачни ланци шаблона ДНА изложени прајмерима. Треба обезбедити пар прајмера (напред и натраг), који би требали бити термостабилни да подносе високе температуре. Примери су једноланчане кратке ДНК секвенце, комплементарне крајевима циљаног ДНК фрагмента. У ПЦР се користе синтетички прајмери. Прајмери ​​се везују за комплементарне базе узорка ДНК и започињу синтезу новог ланца. Овај корак катализује ензим назван Так полимераза; термостабилни ензим ДНК полимераза изолован из Тхермус аукатицус. Кад су доступни прајмери ​​и нуклеотиди (градивни блокови), Так полимераза конструише нови ланац ДНК комплементаран ДНА ДНК-у. На крају ПЦР програма примећен је амплифицирани фрагмент ДНК помоћу гел електрофорезе. Ако је потребна додатна анализа, ПЦР производ се очисти из гела.

ПЦР је веома користан за дијагностицирање и праћење генетских и стечених болести, идентификацију криминалаца (у области форензике), проучавање структуре и функције циљаног сегмента ДНК, секвенцирање и мапирање генома организма, итд. ПЦР је постао рутинска лабораторијска техника у медицинским и молекуларним биолошким истраживачким лабораторијама међу научницима јер има широку употребу.

Слика_2: Ланчана реакција полимеразе

Која је разлика између клонирања гена и ПЦР-а?

Гене Цлонинг вс ПЦР
Клонирање гена је процес прављења вишеструких копија одређеног гена ин виво путем рекомбинантне ДНК и претварања у бактерију домаћина.	ПЦР техника производи више копија одређене ДНК секвенце ин витро кроз понављане циклусе ПЦР реакција.
Захтев за конструкцију рекомбинантне ДНК
Рекомбинантна ДНК се производи да би се лоцирао ген.	Рекомбинантна ДНК се не производи.
Потреба за радном снагом
Овај процес је радно интензиван.	Интензивна радна снага није потребна.
Ин виво или Ин витро поступак
Изградња рекомбинантне ДНК је ин витро и амплификација ДНК је ин виво.	Амплификација ДНК се догађа у потпуности ин витро.

Преглед - Гене Цлонинг вс ПЦР

Клонирање гена и ПЦР су две методе које се користе за амплификацију ДНК. ПЦР је ан ин витро поступак који прави вишеструке копије ДНК одређеног фрагмента ДНК без употребе рекомбинантне ДНК и организма домаћина. Клонирање гена је превасходно ан ин виво поступак који резултира у више копија заинтересованог гена у организму домаћина изградњом рекомбинантне ДНК. Ово је разлика између клонирања гена и ПЦР-а.

Референце:
1. Гриффитхс, Антхони ЈФ. "Клонирање одређеног гена." Савремена генетска анализа. Америчка национална медицинска библиотека, 01. јануара 1999. Веб. 22. фебруар 2017
2. "Ланчана реакција полимеразе (ПЦР)." Национални центар за информације о биотехнологији. Америчка национална медицинска библиотека, н.д. Веб. 22. фебруар 2017

Љубазношћу слике:
1. "Слика 17 01 06" ЦНКС ОпенСтак - (ЦЦ БИ 4.0) преко Цоммонс Викимедиа
2. „ПЦР“ од стране компаније Мадприме - сопствени рад (ЦЦ БИ-СА 3.0) преко Цоммонс Викимедиа