Разлика између сигурнијег секвенцирања и пирокастинга

Кључна разлика - сигурније секвенцирање у односу на пирокастинг
 

ДНК секвенција је веома важна за ДНК анализу јер знање о исправном распореду нуклеотида на одређеној ДНК регији открива многе важне информације о томе. Постоје различите методе секвенцирања ДНК. Сангер секвенционирање и пирокастинг су две различите методе секвенцирања ДНК која се широко користе у молекуларној биологији. Кључна разлика између Сангер секвенцирања и Пиросекуенцес је та Сегер секвенце користи дидеоксинуклеотиде да прекине синтезу ДНК да би се прочитала нуклеотидна секвенца док пироквенционирање открива ослобађање пирофосфата уградњом нуклеотида и синтетизацијом комплементарне секвенце да би се прочитао прецизан редослед секвенце.

САДРЖАЈ
1. Преглед и кључне разлике
2. Шта је сигурније секвенцирање
3. Шта је пироакција
4. Упоредна упоредба - Сангер Секуенцинг вс Пиросекуенцес
5. Резиме

Шта је сигурније секвенцирање?

Сангер секвенцирање је прва метода генерирања ДНК прве генерације коју су развили Фредерицк Сангер и његови колеџи 1977. Такође је позната као Лакнирање прекида ланца или Дидеоки секвенцирање пошто се заснива на прекиду ланца дидеоксинуклеотидима (ддНТП). Ова метода се широко користила више од 30 година све док се није развио нови нараштај секвенце (НГС). Сангер техника секвенцирања омогућила је откривање исправног нуклеотидног реда или везаност одређеног ДНК фрагмента. Заснива се на селективном укључивању ддНТП-а и прекиду синтезе ДНК током ин витро ДНК репликација. Одсуство 3 'ОХ група за наставак стварања фосфодиестерске везе између суседних нуклеотида је јединствена карактеристика ддНТП. Дакле, једном када је прикључен ДДНТП, продужење ланца престаје и престаје од те точке. Постоје четири ддНТП-а - ддАТП, ддЦТП, ддГТП и ддТТП - која се користе у Сангер секвенцирању. Ови нуклеотиди заустављају процес репликације ДНК када су уграђени у растући ланац ДНК и резултирају различитим дужинама кратке ДНК. Капиларна гел електрофореза користи се за организовање ових кратких ланаца ДНК према њиховим величинама на гелу као што је приказано на слици 01.

Слика 1: Електрофореза капиларног гела синтетизованог кратког ДНК

За ин витро репликацијом ДНК, требало би обезбедити мало захтева. То су ензим ДНК полимеразе, шаблонски ДНК, олигонуклеотидни прајмери ​​и деоксиненуклеотиди (дНТП). У Сангер секвенцирању, репликација ДНК се врши у четири одвојене епрувете заједно са четири врсте ддНТП-ова одвојено. Деоксиннуклеотиди нису потпуно замењени одговарајућим ддНТП. Смеша одређеног дНТП-а (на пример; дАТП + ддАТП) је укључена у епрувету и реплицирана. Четири одвојена цеваста производа се стављају на гел у четири одвојена лежишта. Затим читањем гела, секвенца се може конструисати као што је приказано на слици 02.

Слика 02: Сигурније секвенцирање

Сангер секвенционирање је важна техника која помаже у многим областима молекуларне биологије. Пројект хуманог генома успешно је завршен уз помоћ метода које се заснивају на Сангер секвенцирању. Сигурно секвенцирање је такође корисно у циљном секвенцирању ДНК, истраживању рака и генетских болести, анализи експресије гена, идентификацији људи, детекцији патогена, секвенцирању микроба итд..

Постоји неколико недостатака Сангер-ова редоследа:

• Дужина секвенце ДНК не може бити већа од 1000 базних парова
• Одједном се може секвенцирати само један прамен.
• Процес је дуготрајан и скуп.

Због тога су с временом разрађене нове напредне технике секвенцирања како би се ови проблеми превазишли. Међутим, Сангер секвенцирање је још увек у употреби због његових веома тачних резултата до приближно 850 фрагмената дужине основног пара.

Шта је пироакција?

Пирокњижавање је нова техника секвенцирања ДНК заснована на „секвенцирању синтезом“. Ова техника се ослања на детекцију ослобађања пирофосфата након уградње нуклеотида. У процесу се користе четири различита ензима: ДНК полимера, АТП сулфурилаза, луцифераза и апираза и два супстрата аденозин 5 'фосфосулфата (АПС) и луциферин.

Процес започиње везањем прајмера са једноланчаним ДНК обрасцем, а ДНК полимераза започиње уградњом нуклеотида комплементарних њему. Када се нуклеотиди споје (полимеризација нуклеинских киселина), он ослобађа пирофосфатне (две фосфатне групе повезане) и групе. Свако нуклеотидно додавање ослобађа еквимоларну количину пирофосфата. Пирофосфат се претвара у АТП помоћу АТП сулфурилазе у присуству супстрата АПС. Генерисани АТП покреће претворбу луциферина-луциферина у оксилуциферин, стварајући видљиву светлост у количинама које су пропорционалне количини АТП-а. Светлост детектује уређај за откривање фотона или фотомултипликатор и ствара пирограм. Апираза разграђује АТП и не инкорпориране дНТП у реакционој смеши. Додавање дНТП-а врши се један по један. Пошто је познато додавање нуклеотида према инкорпорирању и детекцији светлости, може се одредити редослед обрасца. Пирограм се користи за генерисање нуклеотидне секвенце узорка ДНК, као што је приказано на слици 03.

Пирокњижење је веома важно у анализи полиморфизма са једним нуклеотидом и секвенцирању кратких протеза ДНК. Висока тачност, флексибилност, једноставност аутоматизације и паралелна обрада су предности пиро-следења у односу на Сангер технике секвенцирања.

Слика 03: Пироакционирање

Која је разлика између сигурнијег секвенцирања и пирокастинга?

Сангер Секуенцинг вс Пиросекуенцес
Сангер секвенцирање је метода ДНК секвенцирања заснована на селективном укључивању ддНТП-ова ДНК полимеразом и прекидом ланца.	Пиросекционирање је метода секвенцирања ДНК заснована на детекцији ослобађања пирофосфата по уградњи нуклеотида.
Употреба ДДНТП-а
ДДНТП се користе за прекид репликације ДНК	ддНТП се не користе.
Ензими су укључени
Користи се ДНК полимераза.	Користе се четири ензима: ДНК полимераза, АТП сулфурилаза, Луцифераза и Апираза.
Коришћене подлоге
АПС и Луциферин се не користе.	Користе се аденосин 5 'фосфосулфат (АПС) и луциферин.
Максимална температура
Ово је спор процес.	Ово је брз процес.

Преглед - Сангер Секуенцинг вс Пиросекуенцес

Сангер секвенционирање и пирокастинг су две методе секвенцирања ДНК које се користе у молекуларној биологији. Сангер секвенцирање конструише редослед нуклеотида у низу прекидом продужења ланца, док пироквенционирање конструише тачан редослед нуклеотида у секвенци уградњом нуклеотида и детекцијом ослобађања пирофосфата. Према томе, главна разлика између Сангер секвенцирања и Пиросекуенцес је у томе што Сангер секвенцирање ради на секвенцирању прекидом ланца док пироквенционирање ради на секвенцирању синтезом.

Референце:
1. Факруддин, Мд, и Абхијит Цховдхури. „Пироквенционирање - алтернатива традиционалном сигурнијем секвенцирању.“ Амерички часопис за биохемију и биотехнологију. Сциенце Публицатионс, 02. мар. 2012. Веб. 28. фебруар 2017.
2. "Сигурније секвенцирање." Сангер секвенцирање - СциенцеДирецт теме. Н.п., н.д. Веб. 28. фебруар 2017

Љубазношћу слике:
1. "Дидесоки-Методе" Цхристопх Гоеманс (модифизиерт) - др Норман Маудер, ауф Басис еинер Датеи вон Цхристопх Гоеманс (ЦЦ БИ-СА 3.0) виа Цоммонс Викимедиа
2. "Сангер-ДНА-сек" написао Ензо на Википедији на пољском језику (ЦЦ БИ-СА 3.0) преко Цоммонс Викимедиа
3. „Пироактивација“ микробиолошким бајтовима (ЦЦ БИ-СА 2.0) преко Флицкр